細胞養(yǎng)得好，習(xí)性掌握牢
1不同的細胞喜歡的環(huán)境是不一樣的
這個不僅僅是說培養(yǎng)基的不同，還有就是細胞生長的空間密度問題。有一些細胞是數(shù)量多一點比較好生長，生長狀態(tài)也比較好。這種一般是屬于生長速度慢的細胞。譬如內(nèi)皮細胞。而有一些是細胞是數(shù)量少一點細胞狀態(tài)會生長的比較好，譬如巨噬細胞和某些腫瘤細胞。尤其是巨噬細胞，生長速度非常得快，貼壁速度很快，所以傳代時就應(yīng)該留很少量的細胞，這樣細胞狀態(tài)會比較好。并且巨噬細胞比較喜歡扎堆生長，而堆與堆之間是有空間的。如果長成相連在一起的一滿片的時候，細胞形態(tài)基本上就會差了，老化的會比較多，對后期實驗結(jié)果是不好的。所以在養(yǎng)細胞的時候應(yīng)該摸索該細胞喜歡的生長空間密度問題。
2培養(yǎng)的細胞形態(tài)怎么養(yǎng)都不好
這個其實是有一個方法可以改善的。對于貼壁細胞，如果細胞形態(tài)不好，（或者細胞形態(tài)不清晰，表面似有異物等）可以在傳代的時候進行如下操作：
首先，倒掉舊的培養(yǎng)基，加入3ml新的培養(yǎng)基（有無血清的都可）洗滌一次，用滴管吸走，然后再加入3ml的培養(yǎng)基，進行預(yù)吹打，控制吹打力度，輕輕地大概沿著瓶底過一遍，然后吸走。這時侯再開始正式的消化、吹打。（巨噬細胞建議只吹打，不消化）
其次，把吹打下來的細胞懸液加入到新的培養(yǎng)瓶內(nèi)，培養(yǎng)瓶事先加入培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，按時間點觀察細胞貼壁情況。10分鐘觀察一次，20分鐘，30分鐘觀察一次。選擇一個時間點，已經(jīng)有部分細胞貼壁的情況下，重新置于潔凈臺，底面朝上迅速倒出其中的培養(yǎng)基，加入3ml新培養(yǎng)基再輕輕洗一次。然后加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)。后續(xù)觀察細胞生長情況以及形態(tài)。通常稱之為“二傳”。
如果一次效果還不理想，可重復(fù)多次。直到找到細胞**形態(tài)。其中要注意，結(jié)合細胞喜歡的生長情況。喜歡多一點數(shù)量長得好的細胞你就等貼壁細胞比較多點的時候再傳。反之亦然。
3關(guān)于培養(yǎng)瓶內(nèi)加入培養(yǎng)基量的問題
這個是要靠自己去摸索的。并不是小的玻璃方瓶5ml，大方瓶10ml的。有些細胞反而是培養(yǎng)基少一點相反細胞形態(tài)會長得比較好。（可能也是競爭很大，有優(yōu)勝劣汰吧）。對于生長速度快的細胞，易生長的細胞加少一點培養(yǎng)基細胞形態(tài)會更好。但是要注意換液的掌握。
4關(guān)于選擇培養(yǎng)瓶的問題
個人發(fā)現(xiàn)生長速度快的細胞在玻璃瓶內(nèi)生長的狀態(tài)會比一次性塑料瓶相對好一些。而對于同一種細胞，在其生長旺盛快速的時期在玻璃瓶內(nèi)的生長狀態(tài)也比塑料瓶內(nèi)好。這可能是因為塑料瓶比玻璃瓶更容易貼壁。生長速度快的細胞在塑料瓶這種相對“更安逸”的環(huán)境里反而長得狀態(tài)不如玻璃瓶好。
所以對于生長速度慢的細胞如果想要更漂亮的細胞狀態(tài)，塑料瓶比玻璃瓶會好，對于生長速度快的細胞，玻璃瓶則會更好。同樣，對于同一種細胞，在其生長速度慢的時候，塑料瓶會好一點，比如剛剛復(fù)蘇的時候，或者原代培養(yǎng)的時候。而在其生長旺盛的時候，玻璃瓶則相對會好一點。
5傳代時消化的問題
可以這樣說，對于需要消化傳代的細胞，每一次的消化都是對這個細胞存活與否，狀態(tài)好與不好*至關(guān)重要的考驗。
很多同學(xué)都遇到過這個問題，自己養(yǎng)的細胞開始的幾代長的還挺好的，可是穿過幾代之后就發(fā)現(xiàn)自己的細胞不行了，狀態(tài)越來越差勁了。對于這個問題，可以非?？隙ǖ卣f，你的消化環(huán)節(jié)出問題了。你每一次的消化都讓細胞受到較大損傷了。所以，越長越差。
在消化的過程中，你加入胰酶后，所有細胞都在被胰酶消化著，但是我們忽視了一個問題就是，細胞的生長狀態(tài)是不一樣的，每一個細胞的貼壁情況也是不一樣的，有的貼壁牢固，有的貼壁沒有那么牢固的，所以，讓所有的細胞消化同樣的時間對細胞是不公平的，他們受到了差別待遇當(dāng)然會有脾氣啊。。。呵呵。大家爭取爭取做到因材施教，比如試試下面的“四步消化法”。（以難消化細胞為例）
具體操作
1）.首先不加胰酶，倒掉舊培養(yǎng)基加入少量新培養(yǎng)基洗1-2遍（目的是將漂浮著的死細胞之類盡量洗掉）。
2）.然后再加入少量新培養(yǎng)基直接吹打一遍，這一遍是把貼壁不牢固的細胞吹打下來。再用培養(yǎng)基洗一遍，兩次所得懸液混合傳入新瓶。（你可以將這些傳入新瓶培養(yǎng)，以與后面胰酶消化過的細胞對比觀察看誰長的更好一點就知道該細胞對胰酶的敏感度了。）
3）.吸干凈瓶內(nèi)剩余液體，加入0.3ml左右的胰酶潤洗一遍，吸掉棄之，再加入1ml左右的胰酶消化。消化的同時置于顯微鏡下觀察，待細胞與細胞之間間隙明顯的時候立即吸掉胰酶與干凈子彈頭里備用，加入新培養(yǎng)基開始吹打，吹打2-3遍后吸取懸液于試管或新瓶暫存。用2ml左右新培養(yǎng)基洗一遍與前面的混合。（也可以傳入新瓶培養(yǎng)，以與后面及前面的做對比。）
4）.然后把前面剛吸出來的胰酶重新加進去瓶里繼續(xù)消化剩余的貼壁牢固的細胞。當(dāng)然你也可以用新的胰酶，如果你們那比較富裕的話，呵呵。繼續(xù)鏡下觀察，待剩余細胞間隙明顯，細胞獨立開來的時候，吸掉胰酶，加入新培養(yǎng)基吹打。懸液傳入新瓶培養(yǎng)（根據(jù)實際情況把握）。
6關(guān)于換液傳代時候洗瓶的問題
這個沒有經(jīng)過大規(guī)模驗證。對于用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的細胞，你在洗的時候如果是用無血清1640去洗細胞在隨即后的幾次中會比用DMEM洗的長的要好。同樣，用1640培養(yǎng)的也有這個現(xiàn)象。
如果不嫌麻煩的話，可以用PBS來洗，洗的效果和用無血清培養(yǎng)基洗的效果基本上是一樣的，對于有些細胞會更勝一籌。洗的目的主要是洗去培養(yǎng)瓶里殘留的血清，防止它對胰酶的影響。這樣能夠保證胰酶的消化能力優(yōu)先，是很關(guān)鍵的一點。
